近期，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）李劲松研究组在SCIENCE CHINA Life Sciences发表题为“Temporal regulation of prenatal embryonic development by paternal imprinted loci”的封面文章，利用小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞 (Androgenetic haploid embryonic stem cells, AG-haESCs，又称为“人造精子细胞”) 介导的半克隆技术揭示了雄性配子基因组中两个重要的印记调控区域 (H19-DMR 和 IG-DMR)在出生前胚胎发育过程中的时序调控功能，同时发现敲除H19，H19-DMR和IG-DMR的AG-haESCs可以更加高效地支持半克隆胚胎的发育。

        20世纪80年代，科学家们通过研究单亲胚胎（孤雄或者孤雌）的发育，发现父本和母本的基因组存在差异表达基因，且不可以相互替代，并将这种亲本差异表达基因定义为印记基因。印记基因的差异表达通常受亲本基因组上的差异甲基化区域 (Differential DNA methylation region, DMR)调控，其中两个较早发现的DMR区域（H19-DMR和IG-DMR）在父源基因组上的甲基化修饰，调控这两个印记区域中H19，Igf2，Gtl2，Dlk1，Dio3等印记基因的表达。大量研究显示H19-DMR和IG-DMR在胚胎发育中起到重要的作用，但是，二者是如何协同调控胚胎的发育却一直没有被阐释。

        2012年，李劲松研究组建立了小鼠的孤雄单倍体胚胎干细胞，并证明这些细胞能够代替精子使卵母细胞“受精”产生半克隆小鼠(Yang et al., 2012)。然而，半克隆胚胎的发育率低。进一步研究发现，孤雄单倍体胚胎干细胞中H19-DMR和IG-DMR的甲基化丢失，同时，发育异常的半克隆胚胎也存在H19-DMR和IG-DMR的甲基化丢失；通过删除孤雄单倍体胚胎干细胞的H19-DMR和IG-DMR模拟该区域的甲基化状态，使得半克隆小鼠出生效率提高了10倍。因此，携带H19-DMR和IG-DMR敲除的单倍体细胞又被称为“人造精子细胞”(Zhong C et al., 2015)。这些结果提示“人造精子细胞”可以作为非常理想的材料去研究印记调控区域对于胚胎发育的影响。

        在本研究中，研究人员首先比较了来源于野生型（wild-type, WT）和DKO (H19-DMR and IG-DMR double knock-out) 单倍体胚胎干细胞的半克隆胚胎的体外发育效率以及半克隆囊胚的转录组，发现两者并没有显著差异。具体分析发现，受H19-DMR和IG-DMR调控的H19，Igf2，Gtl2，Dlk1等印记基因在着床前胚胎中的表达水平低，而着床后随着发育的进程表达量不断增加，因此DKO没有对着床前胚胎发生明显作用。

        研究人员进一步将WT和DKO的半克隆胚胎移植到受体母鼠子宫内，并从胚胎期6.5天（E6.5）到E12.5天每天解剖观察胚胎的发育状况，发现DKO半克隆胚胎的着床率高于WT。另外，在E12.5，DKO的发育率显著高于WT。WT的半克隆胚胎从E9.5往后异常发育率不断增加，胎儿不断出现发育阻滞和死亡；而DKO半克隆胚胎的发育缺陷出现在E10.5前，之后，大部分胚胎可以正常发育到期。组织学分析发现，WT半克隆胚胎发育异常的主要原因是胎盘和脐带发育异常导致的胎儿与母体间物质交换受阻，而DKO回补了WT胚胎中异常表达的印记基因，并明显改善了胎盘发育的异常。

        有意思的是，甲基化分析发现异常发育WT半克隆胚胎在E12.5均出现H19-DMR甲基化的擦除，而IG-DMR甲基化擦除存在于异常和正常的胎儿中，暗示着H19-DMR甲基化的正常维持对于半克隆胚胎前半程发育至关重要而IG-DMR的作用不大。为了研究H19-DMR和IG-DMR如何协同发挥功能，研究人员建立了只携带IG-DMR

父性印记调控区H19-DMR和IG-DMR在出生前胚胎发育过程中的时序调控功能